PCR - Polymerase Chain Reaction (IQOG-CSIC)
Talaan ng mga Nilalaman:
- Ano ang reaksyon ng PCR (polymerase chain reaction)?
- Paano nagawa ang PCR (polymerase chain reaction)?
- Bakit mag-uutos ang isang doktor ng isang pagsubok sa PCR (polymerase chain chain)?
- Ano ang RT-PCR?
Ano ang reaksyon ng PCR (polymerase chain reaction)?
Ang reaksyon ng chain ng polymerase (PCR) ay isang pamamaraan na ginagamit upang palakihin ang mga dami ng bakas ng DNA (at sa ilang mga pagkakataon, ang RNA) na matatagpuan o sa halos anumang likido o ibabaw kung saan maaaring mai-deposito ang mga strands ng DNA. Ang susi sa pag-unawa sa PCR ay ang malaman na ang bawat tao, hayop, halaman, parasito, bakterya, o virus ay naglalaman ng genetic material tulad ng DNA (o RNA) na mga pagkakasunud-sunod (mga pagkakasunud-sunod ng nucleotide o mga piraso ng DNA o RNA) na natatangi sa kanilang mga species, at sa indibidwal na miyembro ng species na iyon. Dahil dito, kung ang isang sample ay naglalaman ng mga segment ng DNA o RNA, ang PCR ay isang pamamaraan na ginamit upang palakihin (gumawa ng maraming magkatulad na mga kopya) ng mga natatanging pagkakasunud-sunod upang maaari silang magamit upang matukoy sa isang napakataas na posibilidad ng pagkakakilanlan ng pinagmulan (a tukoy na tao, hayop, o pathogenic na organismo) ng bakas na DNA o RNA na matatagpuan sa o sa halos anumang sample ng materyal.
Ang PCR amplification ay bahagi lamang ng pagkilala sa pagsubok, gayunpaman. Kapag tapos na ang amplification (tingnan sa ibaba), ang mga pinalakas na mga segment ay kailangang ihambing sa iba pang mga segment ng nucleotide mula sa isang kilalang mapagkukunan (halimbawa, isang tiyak na tao, hayop, o pathogenism na organismo). Ang paghahambing na ito ng mga natatanging mga segment ay madalas na ginagawa sa pamamagitan ng paglalagay ng mga pagkakasunud-sunod na nabuong PCR na nabuo sa susunod na kilalang mga pagkakasunud-sunod ng mga nucleotide mula sa mga tao, mga pathogens, o iba pang mga mapagkukunan sa isang naghihiwalay na gel. Ang elektrikal na kasalukuyang ay pinapatakbo sa pamamagitan ng gel at ang iba't ibang mga pagkakasunud-sunod ng nucleotide ay bumubuo ng mga banda na kahawig ng isang "hagdan" ayon sa kanilang singil ng elektrikal at laki ng molekular. Ito ay tinatawag na gel electrophoresis. Ang mga banda o "hagdan" tulad ng mga hakbang na lumilipat sa parehong mga antas sa gel ay nagpapakita ng pagkakakilanlan ng mga pagkakasunud-sunod ng nucleotide. Ang pamamaraang ito ay isa sa mga pinakatanyag na paraan na nakumpleto ang mga pagsubok sa PCR (Tingnan ang Fig 1).
Larawan 1, Mga banda o "hagdan" tulad ng mga hakbang ng PCR na gumagawa ng DNA ng Mycobacterium (kagandahang-loob ng CDC)
Larawan. Ang paulit-ulit na elemento (Rep) –PCR (A) at pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) (B) mga pattern ng Mycobacterium cosmeticum ay nagbubukod mula sa 2 mga pasyente sa Ohio at 1 pasyente sa Venezuela. Ang Rep-PCR ay isinagawa sa pamamagitan ng paggamit ng BOXA1R panimulang aklat (3), at isinagawa ang PFGE na may paghihigpit na enzyme AseI. Lanes 1, 2, ihiwalay ng Ohio ang OH1 at OH2; mga daanan ng 3, 4, kontrolin ang mga ATCC BAA-878T at ATCC BAA-879; lane 5, ang Venezuelan ay ihiwalay ang VZ1. Ang mga pamantayan sa laki ng DNA ay 100-bp (S1) at 48.5-kb marker (S2).
Paano nagawa ang PCR (polymerase chain reaction)?
Noong 1983, nalaman ni Kary Mullis ang mga pangunahing hakbang upang palakasin ang mga pagkakasunud-sunod ng DNA. Siya at Michael Smith ay iginawad sa Nobel Prize para sa pagbuo ng pamamaraang ito noong 1993. Mayroong ilang mga pangunahing hakbang na sinusunod sa pagkakasunud-sunod; Ang PCR ay maaaring gawin sa isang solong tubo na may naaangkop na mga kemikal at isang espesyal na idinisenyo na pampainit. Ang mga reagents o kemikal na kailangan ay ang mga sumusunod:
- Isang sample na naglalaman ng pagkakasunud-sunod ng nucleotide (mula sa dugo, buhok, pus, pag-scrape ng balat, atbp.)
- Mga primer ng DNA: maikling maiikling stranded na DNA na nakakabit sa mga pagkakasunud-sunod ng nucleotide na nagtataguyod ng synthesis ng isang pantulong na strand ng mga nucleotides
- Ang polymerase ng DNA: isang enzyme na, kapag ang DNA ay may panimulang nakatali, bumababa ang segment ng DNA na nakakabit ng mga bloke ng gusali ng DNA upang makabuo ng mga pantulong na pares ng base at sa gayon synthesize ang isang pantulong na nucleotide strand ng DNA (ang pagpapakilala ng isang heat-resistant DNA polymerase, Taq polymerase, na nagmula sa bakterya na lumalaban sa init, kapansin-pansin na pinabuting ang kakayahang magsagawa ng PCR)
- Ang isang malaking labis ng mga bloke ng gusali ng DNA na tinatawag na mga nucleotides (Adenine, Thymidine, Cytosine, at Guanine, na dinaglat bilang: A, T, C, at G, ayon sa pagkakabanggit) ay naroroon sa solusyon. Kapag ang mga bloke na ito ay magkakaugnay, bumubuo sila ng pagkakasunud-sunod ng nucleotide o isang solong strand ng DNA. Kapag ang mga bloke ng gusaling ito ay nagbubuklod sa kanilang pantulong na bloke ng gusali sa pamamagitan ng mahina na mga bono ng hydrogen (halimbawa, ang A ay magbubuklod lamang sa T at G lamang sa C) isang pantulong na pagkakasunud-sunod ng DNA nucleotide ay nabuo at nakasalalay sa orihinal na solong-stranded na DNA. Kapag nakumpleto ang pagbubuklod, ang isang pantulong na double strand DNA ay nabuo sa isang tiyak na pagkakasunud-sunod.
Kung gayon, ang PCR ay nagsisimula sa isang segment ng DNA mula sa isang sample na nakalagay sa isang tubo na may mga reagents na nakalista sa itaas. Ang solusyon ay pinainit ng hindi bababa sa 94 C (201.2 F); ang init na ito ay sumisira sa mga bono ng hydrogen na nagpapahintulot sa mga pantulong na mga strands ng DNA, kaya ang mga solong strand lamang ang umiiral sa halo (ito ay tinatawag na denaturation ng dobleng-stranded na DNA).
Ang halo ay pinapayagan na palamig sa halos 54 C (129.2 F). Sa temperatura na ito, ang mga primer ng DNA at ang polymerase ng DNA ay nakasalalay sa mga indibidwal na solong-stranded na DNA (ito ay tinatawag na annealing ng DNA). Dahil ang mga bloke ng gusali ay labis (mataas na konsentrasyon) sa halo, ginagamit ang polymerase upang makagawa ng mga bagong pantulong na strand ng DNA (termed extension ng DNA) at ang prosesong ito ay mas mabilis sa 72 C (161.6 F). Ang prosesong ito ay lumilikha ng isang bagong double-stranded na molekula ng DNA mula sa bawat isa sa mga solong strand ng orihinal na molekula.
Ang siklo na ito ay paulit-ulit tungkol sa 40 beses sa isang makina na tinatawag na isang thermal cycler na awtomatikong inuulit ang mga siklo ng pag-init ng paglamig, na may halaga ng bawat pagkakasunud-sunod ng DNA na pagdodoble sa tuwing nakumpleto ang pag-init ng paglamig. Kung ano ang una ay isang solong maikling bahagi ng DNA ay maaaring mapalaki sa halos 100 bilyong kopya pagkatapos ng 40 pagdodoble.
Bakit mag-uutos ang isang doktor ng isang pagsubok sa PCR (polymerase chain chain)?
Ang pagsusulit sa PCR ay bumubuo ng batayan ng isang bilang ng mga pagsubok na maaaring sagutin ang maraming magkakaibang mga medikal na katanungan na makakatulong sa mga doktor na mag-diagnose at magamot sa mga pasyente. Halimbawa, ang mga pagsusuri sa PCR ay maaaring makakita at makilala ang mga pathogen organismo sa mga pasyente, lalo na sa mga mahirap na linangin (halimbawa, HIV at iba pang mga virus at ilang fungi).
Ang iba pang mga doktor ay nag-uutos ng mga pagsusuri sa PCR upang matulungan ang pag-diagnose ng mga sakit sa genetic, habang ang ibang mga doktor ay gumagamit ng PCR upang makita ang mga kaugnay na biological tulad ng pagkilala sa mga magulang ng mga bata. Ginagamit din ang mga pagsusuri sa PCR upang makilala at makilala ang mga genetic mutations at muling pagbubuo na matatagpuan sa ilang mga cancer.
Gayunpaman, ang mga pagsusuri sa PCR ay nabago at pinalawak sa maraming mga aspeto ng pang-agham na pagsisiyasat kabilang ang evolutionary biology, genetic fingerprinting, forensic investigations, at marami pa.
Ano ang RT-PCR?
Ang RT-PCR ay isang pagsubok sa PCR na idinisenyo upang makita at masukat ang RNA. Bagaman ang mga paunang pagsusuri sa PCR ay nagpalakas ng DNA, maraming mga virus at iba pang mga biological sangkap (halimbawa, mitochondria) ang gumagamit ng RNA bilang kanilang genetic material. Ang RT-PCR ay naiiba sa maginoo PCR sa pamamagitan ng unang pagkuha ng RNA at pag-convert ng RNA strand sa isang strand ng DNA. Ginagawa ito sa pamamagitan ng mahalagang parehong pamamaraan para sa PCR na inilarawan sa itaas maliban sa paggamit ng isang enzyme na tinatawag na reverse transcriptase sa halip na ang DNA polymerase. Ang reverse transcriptase ay nagpapahintulot sa isang solong strand ng RNA na isalin sa isang pantulong na strand ng DNA. Sa sandaling naganap ang reaksyon na iyon, ang nakagawiang pamamaraan ng PCR ay maaaring magamit upang palakihin ang DNA. Ang RT-PCR ay ginamit upang makita at pag-aralan ang maraming mga virus ng RNA.
Hindi dapat malito ang RT-PCR sa isa pang pagkakaiba-iba ng PCR, na tinatawag na Real-Time PCR. Ang Real-Time PCR ay isang pagkakaiba-iba ng PCR na nagbibigay-daan sa pagsusuri ng amplified DNA sa panahon ng karaniwang 40 na mga siklo ng pamamaraan. Bagaman ang pamamaraan ay katulad sa maginoo PCR na may pagbibisikleta, ang Real-Time PCR ay gumagamit ng mga fluorescent dyes na nakakabit sa ilang mga bloke ng gusali o maliit na mga strand ng nucleotide. Nakasalalay sa pamamaraan na ginamit, ang fluorescence ay nangyayari kapag nabuo ang pinalaki na mga strand ng DNA. Ang dami ng fluorescence ay maaaring masukat sa buong 40 cycle at pinapayagan ang mga investigator na masukat ang mga tiyak na produkto at ang kanilang mga halaga sa panahon ng mga ikot ng amplification. Madalas nitong pinapayagan ang mga investigator o technician ng lab na laktawan ang mga electrophoresis ng gel o iba pang mga pangalawang pamamaraan na kinakailangan para sa pagsusuri ng mga produkto ng PCR, kaya gumagawa ng mas mabilis na mga resulta.
Ang Real-Time PCR at RT-PCR ay mga pagkakaiba-iba o pagbabago ng orihinal na pagsubok sa PCR. Gayunpaman, maraming mga pagkakaiba-iba (hindi bababa sa 25) na umiiral at ginagamit upang malutas ang mga tiyak na problema. Lahat sila ay may iba't ibang mga pangalan tulad ng Assembly PCR, Hot-start PCR, Multiplex PCR, Solid-phase PCR at marami pang iba.
Ang PCR ay malamang na patuloy na mabago upang makatulong na sagutin ang anumang iba pang mga katanungan sa gamot, biology. at iba pang larangan ng pag-aaral.
